Q1、做細胞信號傳導，要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？
A1：對二抗無要求，要看你實驗條件來選擇，一般推薦用HRP標記的二抗。

Q2、同一公司的不同抗體用某個稀釋度對一種抗體效果好，另外一種抗體可不可以用同種稀釋度進行稀釋？
A2：不同抗體，即使是同一公司的抗體，其最佳的抗體稀釋度也是不一樣的，需要進行實驗摸索。

Q3、免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎？
A3：免疫組化時抗體識別的是未經變性處理的抗原決定簇(又稱表位)，有些表位是線性的，而有的屬于構象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有構象型表位由于受蛋白空間結構限制，煮后變性會消失。如果你所用的抗體識別的是蛋白上連續的幾個氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時用于免疫組化和Western，而如果抗體識別構象形表位，則只能用于免疫組化。

Q4、Western Blot 中抗體的重復應用問題
A4：抗體工作溶液一般不主張儲存反復使用，但是如抗體比較珍貴，可反復使用2－3次。稀釋后應在2－3天內使用，4℃保存，避免反復凍融。

Q5、做western每次只加一種一抗，可以同時加兩種或者多種一抗的嗎？
A5：最好還是不要同時加兩種一抗。因為如果結果里面有非特異信號的話，就說不清楚了。做Western在同一張膜上檢測目的蛋白和內對照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL顯色、壓片、洗片；漂洗以后，再上內對照的一抗、二抗，ECL顯色、壓片、洗片。