二抗在免疫學實驗中起著舉足輕重的作用，二抗的選擇也決定了整個實驗的成敗。實驗中在選擇二抗時必須注意以下幾點：

(1)一抗種屬來源
主要根據一抗種屬來源來決定確定二抗的類型，如一抗是小鼠來源，那二抗就買抗小鼠的即可(如羊抗小鼠、兔抗小鼠等均可)。

(2)一抗類型

二抗需與一抗的類別或亞類相匹配。這通常是針對單克隆抗體而言。多克隆抗體主要是IgG類免疫球蛋白，因此相應的二抗就是抗IgG抗體。
單克隆抗體的類別及亞類通常會在產品說明書中都會有描述，如果你的一抗是小鼠IgM，那么相應的二抗就應當是抗小鼠IgM。
如果單克隆一抗是小鼠IgG的某一亞類(IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3)，那么幾乎所有的抗小鼠IgG都可以與之結合，或者你也可以選擇專門針對這一亞類的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠IgG1，那么你可以選擇抗IgG1的二抗，此種抗體在雙標記實驗中尤其適合。
在不清楚一抗為何種類/亞類的情況下，可以選用抗相應物種IgG。

(3)標記物的選擇
一般來講，耦聯到二抗上的探針主要有酶(辣根過氧化酶HRP和堿性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP)，熒光基團(FITC, RRX, TR, PE)和生物素。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實驗。對于western blot和ELISA，常用的二抗是酶標二抗，而細胞或組織標記實驗(細胞免疫化學，組織免疫化學，流式細胞術)中通常使用熒光基團標記的二抗，免疫組化中也可以使用辣根過氧化酶或堿性磷酸酶標記的二抗。如果想要更大程度的放大檢測信號，可以使用biotin/avidin檢測系統。